L’impact de structures G-quadruplex sur la biogénèse d’ARN circulaires

Abstract

Environ 98% des ARN d’une cellule eucaryote sont des ARN non codants. Parmi ceux-ci, une nouvelle classe d’ARN, les ARN circulaires (circARN), sont apparus comme des acteurs clés dans la régulation de nombreux processus cellulaires. Ces transcrits alternatifs, issus de la circularisation des exons d'ARNm, ont de nombreux rôles dans la régulation de la transcription, de la traduction ou encore de la production d'isoformes protéiques. Bien que généralement peu exprimés et difficilement détectables, des études récentes ont démontré l'implication de cette classe d'ARN dans la progression et la résistance tumorale. Néanmoins, bien que de nombreux éléments (ex : ALU éléments, les protéines liant l’ARN) aient été révélés comme des acteurs de la circularisation, l’ensemble des mécanismes d’épissage de ces ARN restent peu compris. Par ailleurs, des structures d’ARN, tels que les G-quadruplex (rG4), sont connues comme étant très répandues dans le transcriptome et sont rapportées comme des acteurs majeurs de l’épissage alternatif. Une étude bio-informatique sur les circARN identifiés chez H. Sapiens a conduit à la découverte d’un bon nombre de structures G-quadruplex potentielles (pG4) dans les circARN. La présente étude s'est concentrée sur 5 circARN présentant des pG4 à proximité des jonctions de rétro-épissage. Cinq séquences d’ARN sauvages (WT) et 5 séquences mutées (G/A) ont été testées in vitro. L’utilisation de tests de fluorescence NMM et d’essais de cartographie in-line ont permis de valider in vitro la formation des 5 rG4 dans les séquences WT et confirmer que les mutations G/A empêchaient de former des rG4. Par la suite, l’implication du rG4 dans la biogénèse d’un candidat : circATXN7, a été validée in cellulo par des essais de transfection de vecteurs d'expression contenant les séquences WT ou G/A du rG4 de circATXN7. Les niveaux d’abondances de circATXN7 ont été quantifiés par l’extraction de l’ARN total des cellules transfectées suivi de RT-qPCR et ont révélé que circATXN7 WT est plus exprimé que circATXN7 G/A. Finalement, l’impact de la formation du rG4 sur la biogenèse de circATXN7 a été validé par l’utilisation d’oligonucléotides déstabilisant la formation du rG4. Cette expérience a pu mettre en évidence une baisse d’expression de circATXN7 et une surexpression de l’ARN linéaire d’ATXN7 lorsque le rG4 est déstabilisé. En somme, cette étude a révélé la formation d’un rG4 comme étant un élément clé de la biogenèse et de la fonction d’un circARN. Abstract : Approximately 98% of RNA in a eukaryotic cell consists of non-coding RNA. Among them, a new class of RNA known as circular RNAs (circRNAs) has emerged as key regulators of numerous cellular processes. These alternative transcripts, produced through exon circularization from mRNA, play important roles in regulating transcription, translation, and the generation of protein isoforms. Although typically expressed at low levels and difficult to detect, recent studies have demonstrated their involvement in tumor progression and therapy resistance. Despite the identification of several factors involved in circularization—such as ALU elements and RNA-binding proteins—the splicing mechanisms responsible for circRNA formation remains poorly understood. Additionally, RNA secondary structures, such as Gquadruplexes (G4s), are known to be widespread across the transcriptome and have been reported as major regulators of alternative splicing. A bioinformatic study on circRNA identified in H. sapiens led to the discovery of a significant number of potential G-quadruplex structures (pG4) within circRNA. The present study focused on five circRNA containing pG4 located near backsplicing junctions. Five wild-type (WT) RNA sequences and five mutated sequences (G/A) were tested in vitro. The formation of the five pG4 was validated in vitro in the WT sequences and showed that the G/A mutants are unable to form rG4, as demonstrated by NMM fluorescence assays and inline probing assays. Subsequently, the role of the rG4 in one candidate—circATXN7—was validated in cellulo. The involvement of the rG4 in the biogenesis of this candidate was confirmed through transfection of expression vectors containing either the WT or G/A mutant rG4 sequences of circATXN7. The abundance levels of circATXN7 were quantified by RTqPCR following RNA extraction, revealing that WT circATXN7 is more expressed than the G/A mutant form. Finally, the impact of the rG4 formation on circATXN7 biogenesis was validated using antisense oligonucleotides that destabilize rG4 formation. This experiment showed a decrease in circATXN7 expression and an upregulation of the linear ATXN7 RNA when the rG4 was destabilized. In summary, this study revealed rG4 formation as a key element in the biogenesis and function of a circRNA.